Laporan Praktikum Biologi Molekuler Teknik Isolasi DNA Tanaman Kelor (Moringa oleifera)

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isolasi DNA merupakan teknik dasar dari bioteknologi dan biomolekular yang harus dikuasai di laboratorium. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel lainnya seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Secara umum, tahapan isolasi DNA untuk berbagai bahan adalah lisis sel atau jaringan yang efektif, denaturasi kompleks nukleoprotein, dan inaktivasi nuclease (Hariyadi et al., 2018). Hasil isolasi kemudian dapat dilihat dalah satunya melalui spektrofotometer atau nanodrop yang berfungsi untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasi DNA genom (Mutiyaningsih, 2017).

Tanaman kelor memiliki ragam manfaat baik untuk kesehatan, pangan, kecantikan maupun lingkungan yang dapat dibudidayakan di lahan pekarangan untuk konsumsi sehari-hari. Selain sebagai sumber nutrisi, kelor juga digunakan sebagai tanaman herbal untuk tindakan pencegahan dan pengobatan penyakit tertentu. Kandungan nutrisi yang kompleks menjadikan tanaman kelor memiliki banyak fungsi dan telah dimanfaatkan pada berbagai bidang (Wahyudi dan Muin, 2017). Manfaat yang terkandung pada tumbuh-tumbuhan telah dijelaskan dalam Al-Quran surah As-Syuara ayat 7 yang artinya:

“Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, betapa banyak Kami tumbuhkan di bumi itu berbagai macam (tumbuh-tumbuhan) yang baik?”

Ayat tersebut menjelaskan bahwa Allah telah menciptakan bermacam tumbuh tumbuhan yang baik termasuk salah satunya yaitu tanaman kelor. Manfaat dan kandungan nutrisi pada daun kelor menjadikannya berpotensi untuk pengembangan potensi unggul yang salah satunya dilakukan dengan analisis genetik. Tahap awal analisis genetik suatu tanaman adalah isolasi DNA tanaman tersebut. Seperti yang dijelaskan Hariyadi et al. (2018) bahwa Isolasi DNA berguna untuk beberapa analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti genom editing, transformasi dan PCR. Artikel yang ditulis oleh Restu et al. (2012) juga menjelaskan bahwa optimasi perlu dilakukan dalam prosesnya karena seringnya terjadi kesalahan dalam proses isolasi DNA menghasilkan isolat yang tidak maksimal untuk digunakan. Oleh karena itu, penting untuk memperhatikan tiap prosedur dalam isolasi DNA. Hal inilah yang mendasari dilaksanakannya praktikum ini. Selain itu, diharapkan dengan adanya praktikum ini merupakan wujud kita dalam mengkaji dan mempelajari ciptaan-Nya serta dapat menambah keimanan dan ketakwaan kita kepada Allah SWT.

1.2 Tujuan

Tujuan dalam praktikum ini yaitu sebagai berikut.

1. Untuk mengetahui tahapan isolasi DNA pada tumbuhan kelor (Moringa oleifera)
2. Untuk mengetahui hasil kuantitatif pembacaan Nano Drop isolasi DNA tumbuhan kelor (Moringa Oleifera)

[inline_ads]

BAB II KAJIAN PUSTAKA

2.1 Tahapan Isolasi DNA

Lisis

Lisis merupakan tahap awal dan salah satu yang terepenting yang bertujuan untuk melepas asam nukleat dengan cara menghancurkan membran sel dan nukleus. Lisis dapat dilakukan dengan metode kimiawi, akustik, elektrik, dan mekanis. Metode lisis yang paling umum digunakan adalah lisis mekanis (So et al., 2014). Lisis mekanik dilakukan dengan penggerusan dengan menggunakan nitrogen cair dan inkubasi dengan menggunakan perlakuan suhu (Hariyadi et al., 2018).

Ekstraksi

Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari membran sel, protein, dan komponen seluler lainnya (Gupta, 2019).  Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan beberapa metode seperti metode organik (phenol dan chloroform) dan metode berbasis silika (silica membrane dan silica beads) (Rothe & Nagy, 2016). Menurut (Yalçınkaya et al., 2017) beberapa contoh metode ekstraksi DNA yaitu Metode Tris-EDTA, Metode Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) yg dimodifikasi, Metode Alkaline, Metode Urea, Metode Garam, Metode Guanidinium Isothiocyanate (GuSCN), Metode Wizard, Metode Qiagen, Metode Zymogen, dan Metode Genespin.

Purifikasi

Purifikasi DNA sangat umum digunakan untuk mendapatkan sampel asam nuklear yang murni atau berkualitas tinggi (Topçu et al., 2016). Metode yang umum digunakan dalam purifikasi DNA adalah metode berbasis sentrifugasi (Vanyorek, 2019).

2.2 Fungsi Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum serta fungsinya yaitu CTAB, merupakan buffer standar yang digunakan dalam isolasi DNA yang mengandung komponen dan konsentrasi garam yang tinggi. Buffer ini berperan dalam pelisisan sel yang mampu menghilangkan polisakarida (Sirait et al., 2018). Cloroform dan Isoamil alkhol, berperan untuk mengikat makromolekul selain DNA seperti protein, lipid, dan karbohidrat (Kamaliah, 2017). Kloroform mendenaturasi protein sedangkan isoamil alkohol untuk menghilangkan busa (Sirait et al., 2018).

Nitrogen cair, memiliki suhu sangat rendah -196^oC yang dapat membekukan sel sehingga lebih mudah digerus (Sirait et al., 2018). Daun muda kelor, digunakan sebagai sampel yang diuji, Daun yang masih muda umumnya memiliki metabolit sekunder lebih sedikit dibandingkan daun tua sehingga lebih mudah digerus. Selain itu, sifatnya masih meristematis atau aktif membelah sehingga kandungan DNA nya lebih banyak (Sirait et al., 2018).  RNAse, ditambahkan dengan tujuan untuk menghilangkan RNA pada larutan DNA (Murtiyaningsih, 2018).

[inline_ads]

Tisu, digunakan untuk memisahkan filtrat dengan ampas daun (Sirait et al., 2018). Etanol 70%, digunakan dalam membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Selain digunakan dalam tahap pencucian DNA, etanol 70% juga digunakan untuk presipitasi DNA (Farmawati et al., 2015). Isopropanol, ditambahkan untuk mengendapkan DNA (Hartawan et al., 2015). Setelah penambahan isopropanol dingin secara perlahan, akan terbentuk 3 lapisan pada tabung reaksi (Sirait et al., 2018). TE Buffer atau aquadest steril, memiliki fungsi sebagai pengelusi agar DNA terlepas dari diatom dan berada pada supernatan, sehingga tahap akhir diambil supernatan yang mengandung DNA (Farmawati et al., 2015). Alkohol, digunakan untuk menarik air dari DNA (Kamaliah, 2017).

2.3 Riset Isolasi DNA

Riset yang dilakukan Rizko et al. (2020) dengan judul “Isolasi DNA Daun Jeruk Bali Merah (Citrus maxima Merr.) dengan Modifikasi Metode Doyle and Doyle” melakukan isolasi DNA pada daun jeruk bali dengan metode Doyle & Doyle yang dimodifikasi dengan penambahan CTAB untuk mengatasi kadungan polisakarida dan senyawa polifenol yang tinggi dalam tanaman jeruk bali. Setelah diisolasi, sampel dianalisis menggunakan NanoDrop dengan absorbansi (A260/A280). Hasil pada penelitian ini, sampel DNA yang dianalisis memiliki konsentrasi 220,8ng/µl serta kemurnian sebesar 1,93. Riset yang dilakukan Syafaruddin et al. (2011) dengan judul “efektivitas dan efisiensi teknik isolasi dan purifikasi DNA pada jambu mete” menunjukkan bahwa kuantitas DNA yang banyak dan kualitas DNA yang tinggi dapat dihasilkan pada sampel tanaman jambu mete dengan cara memodifikasi teknik ekstraksi DNA berbasis Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) serta penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol, namun tanpa penggunaan nitrogen cair. Selanjutnya, untuk isolasi DNA tanaman tahunan lain yang mempunyai kemiripan dengan jambu mete atau yang mempunyai kandungan phenol tinggi, disarankan untuk mengikuti protokol seperti yang dilakukan pada jambu mete.

[inline_ads]

BAB III METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum yang berjudul “Isolasi DNA pada tanaman kenlor (Moringa oleifera) dilaksanakan pada hari jumat, 17 Desember 2021 pada pukul 09.50 WIB sampai selesai. Praktikum berlangsung di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler, Program Studi Biologi.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah:

1. Timbangan analitik (1 buah)
2. Microtube (3 buah)
3. Vortex (1 buah)
4. Micropipet (3 buah)
5. Blue tip (1 buah)
6. Yellow tip (1 buah)
7. Sentrifugasi (1 buah)
8. Waterbath (1 buah)
9. Nano Drop (1 buah)
10. Rak microtube (1 buah)
11. Gloves (1 pasang)
12. Mortal (1 buah)
13. Restle (1 buah)
14. White tip (1 buah)
15. Beaker glass (1 buah)

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah:

1. Daun muda kelor (3 gram)
2. Nitrogen cair (secukupnya)
3. CTAB buffe (700 mikrolit)
4. RNAse (1 mikrolit)
5. Chloroform (576, 878, 648 mikrolit)
6. Tisu (secukupnya)
7. Isoamil alkohol (24, 37, 27 mikrolit)
8. Etanol 70% (500 mikrolit)
9. Iso propanol (500 mikrolit)
10. TE buffer (50 mikrolit)
11. Alkohol (secukupnya)

3.3 Langkah Kerja

Langkah-langkah yang digunakan dalam praktikum ini adalah:

1. Ditimbang sampel daun kelor yang masih muda sebanyak 9 gram. Kemudian diletakkan di mortal
2. Ditambahkan nitrogen cair. Setelah itu dihancurkan menggunakan pestle
3. Sampel yang telah halus kemudian dimasukkan ke microtube sebanyak 0,5 mikrolit
4. Ditambahkan 700 mikrolit CTAB Buffer dan RNAse sebanyak 1 mikrollit ke dalam sampel.
5. Dibolak-balik microtube yang berisi samppel. Kemudian di vortex selama 2 menit.
6. Microtube berisi sampel dihangatkan dengan water bath (66oC) selama 10 menit. Microtube berisi sampel dibolak-balik setiap 2 menit.
7. Disentrifuge sampel selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm
8. Selain disentrifuge, dipisahkan cairan bening pada sampel ke microtube yang baru. Kemudian, dihitung volumenya, berikut adalah perhtungannya
   • Ulangan 1 = 420 mikrolit
   • Ulangan 2 = 320 mikrolit
   • Ulangan 3 = 460 mikrolit
9. Ditambahkan kloroform dan isoamil alkohol dengan pebandingan konsentrasi 24:1 berikut perhitungannya
10. Disentrifuge selama 3 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
11. Diambil supernatant, lalu ditambahkan isopropanol 500 mikrolit. kemudian disentrifuge selama 3 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
12. Ditambahkan etanol dingin 70% pada sampel sebanyak 500 ml. kemudian disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm
13. Dibuang etanol dan dikeringkan selama sekitar 15 menit
14. Ditambahkan TE buffer 50 mikrolit.
15. Diuji sampel secara kuantitatif dengan Nano Drop.

[inline_ads]

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Nano Drop

Hasil analisis menggunakan Nano Drop ditunjukkan pada tabel berikut.

Ulangan ke-	260/230	Abs230	Abs260	Abs280	260/280	Konsentrasi
1	1,16	1,77	2,04	2,09	0,98	102,14
2	1,09	24,41	26,48	31,85	0,83	1324,2
3	1,62	8,21	13,29	10,65	1,25	664,26

4.2 Pembahasan

Praktikum isolasi DNA daun muda tanaman kelor (Moringa oleifera) dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu lisis, ekstraksi, dan purifikasi. Daun muda digunakan menurut Sirait et al. (2018) yaitu karena daun yang masih muda umumnya memiliki metabolit sekunder lebih sedikit dibandingkan daun tua sehingga lebih mudah digerus. Selain itu, sifatnya masih meristematis atau aktif membelah sehingga kandungan DNA nya lebih banyak. Pertama-tama, pada tahap lisis, ditimbang 3gram daun kelor muda kemudian dilisiskan secara mekanik dengan cara digerus menggunakan mortal dan pestle dan ditambahkan nitrogen cair. Kelor selanjutnya dimasukkan ke dalam tube dan diberi larutan CTAB Buffer sebanyak 700 mikrolit dan RNAse 1 mikrolit.

Tahap ekstraksi selanjutnya dilakukan dengan membolak-balik tube dan di vortex selama 2 menit. kemudian, dihangatkan pada waterbath dengan suhu 66oC selama 10 menit dengan terus membolak balik sampel setiap 2 menit.  Setelah selesai, disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Kemudian, cairan bening pada tube dipisahkan dan dipindahkan pada tube baru dan dihitung volumenya. Kemudian, disentrifugasi lagi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.  Selanjutnya, dilakukan penambahan kloroform dan isoamil alcohol dan Kembali disentrifugasi. Setelah selesai, diambil supernatan (cairan bening di atas) dan ditambah isopropanol sebanyak 500 mikrolit dan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.

Tahap purifikasi yaitu sampel yang telah disentrifugasi kemudian membentuk pellet (endapan). Sisa reagen yang masih ada dipisahkan dengan tisu. Selanjutnya, ditambahkan etanol dingin 70% sebanyak 500 mikrolit dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Setelah itu etanol dibuang dikeringkan lalu ditambahkan TE Buffer 50 mikrolit. 

Langkah terakhir yang dilakukan dalam praktikum yaitu dilakukan uji nanodrop terhadap sampel DNA yang diperoleh. Berdasarkan hasil pembacaan NanoDrop, diperoleh hasil ulangan pertama memiliki nilai absorbansi 0,98 dengan konsentrasi 102,14. Ulangan kedua memiliki nilai absorbansi 0,83 dengan konsentrasi 1324,2. Kemudian ulangan ketiga dengan nilai absorbansi 1,25 dengan konsentrasi 664,26.

Langkah-langkah yang dilakukan pada praktikum serupa dengan tahapan isolasi DNA yang dilakukan oleh Rizko et al., (2020) yaitu diawali dengan penimbangan, penggerusan, penambahan CTAB, inkubasi, divortex, disentrifugasi, pengambilan supernatant, penambahan dan penambahan isopropanol dingin sebanyak untuk presipitasi DNA. Selanjutnya, dilakukan inkubasi dan sentrifugasi Kembali hingga terbentuk pellet. Sampel kemudian dikering-anginkan, ditambah alkohol 70% hingga kontaminan hilang, lalu kemudian dipisahkan segala reagen lain dari pellet dan ditambahkan bufer TE 50 µl.

Hasil akhir yang diperoleh menunjukkan hasil paling baik yaitu pada ulangan ketiga. Meskipun konsentrasi paling banyak yaitu pada ulangan kedua dengan konsentrasi 1324,2 tetapi berdasarkan kemurniannya, ulangan tiga memiliki nilai yang lebih besar dengan konsentrasi yang sedang.  Pernyataan ini didukung oleh Rizko et al., (2020) bahwa nilai konsentrasi tinggi belum tentu nilai kemurniaannya tinggi. Jika nilai λ260 yang merupakan nilai untuk DNA tinggi maka nilai konsentrasi akan tinggi. Nilai kontaminan untuk kemurnian DNA dipengaruhi oleh nilai λ280 sehingga meskipun nilai konsentrasi DNA tinggi bukan berarti nilai kemurnian akan tinggi juga.

Hasil yang diperoleh pada ketiga ulangan tersebut masih menunjukkan adanya kontaminasi dari protein, lemak, dan metabolit sekunder. Hal ini didukung oleh pernyataan dan penelitian yg dilkaukan Rizko et al., (2020) bahwa DNA digolongkan berkualitas baik apabila berdasarkan uji nanodrop memiliki kemurnian 1,8 – 2,0 dan konsentrasi di atas 100 ng/µl. Angka yang memiliki nilai perbandingan λ260/λ280 kurang dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminan fenol atau senyawa protein yang ikut terbawa selama proses ekstraksi berlangsung. Metode CTAB klasik memiliki kemurnian DNA rata-rata dibawah 1,8. Hasil isolasi yang tidak murni diduga disebabkan oleh ketidakmaksimalan dalam proses lisis sel maupun pada tahap purifikasi. Hal ini didukung oleh pernyataan Hariyadi et al., (2018) bahwa proses lisis adalah proses awal yang menentukan keberhasilan suatu isolasi DNA. Selain itu, Rizko et al. (2020) juga menjelaskan bahwa meskipun tahapan pada masing-masing sampel sama, namun hasil akhir konsentrasi dan kemurnian setiap sampel berbeda. Hal ini dapat dipengaruhi oleh penambahan sejumlah bufer yang sama saat presipitasi DNA padahal masing-masing sampel memiliki kandungan DNA yang berbeda. Selain itu, proses pencucian dengan etanol juga dapat mempengaruhi konsentrasi dan kemurnian DNA. Semakin banyak sampel dicuci dengan etanol, kemurnian DNA semakin tinggi, namun konsentrasi DNA semakin turun.

[inline_ads]

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum ini yaitu sebagai berikut.

1. Tahapan isolasi DNA umumnya dilakukan melalui tiga tahapan yaitu lisis, ekstraksi dan purifikasi. Lisis bertujuan untuk melepas asam nukleat dengan cara menghancurkan membran sel dan nukleus melalui penggerusan dan pemberian nitrogen cair. Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari membran sel, protein, dan komponen seluler lainnya dengan pemberian larutan-larutan seperti kloroform, isoamil alkohol, dan isopropanol. Purifikasi DNA sangat umum digunakan untuk mendapatkan sampel asam nuklear yang murni atau berkualitas tinggi, dilakukan dengan metode sentrifugasi.
2. Hasil kuantitatif pembacaan NANO DROP isolasi DNA tumbuhan kelor (Moringa Oleifera) menunjukkan hasil yang diperoleh pada ketiga ulangan tersebut masih menunjukkan adanya kontaminasi dari protein, lemak, dan metabolit sekunder dibuktian dengan angka pembacaan absorbansi pada Nano Drop masih dibawah standar yang seharusnya. Akan tetapi, Hasil akhir yang diperoleh menunjukkan hasil paling baik yaitu pada ulangan ketiga dengan nilai absorbansi 1,25 dengan konsentrasi 664,26. berdasarkan kemurniannya, ulangan tiga memiliki nilai yang lebih besar dengan konsentrasi yang sedang.

5.2 Saran

Saran dari praktikum ini yaitu tahapan tahapan dalam tiap proses isolasi perlu diperhatikan dengan lebih baik lagi karena dapat berpengaruh terhadap hasil akhir kemurnian dan konsentrasi DNA. Kurangnya perhatian dan ketelatenan dalam tiap prosesnya dapat menjadi faktor terjadinya kontaminasi pada hasil akhir isolasi DNA.